TRANSFER GEN APETALA1 KETANAMAN MANGGIS UNTUK MEMPERCEPAT PROSES PEMBUNGAAN DENGAN A. Tumefaciens

PENDAHULUAN

Latar balakang

Manggis merupakan tanaman buah berupa pohon yang berasal dari hutan tropisyang teduh di kawasan Asia Tenggara, yaitu hutan belantara Malaysia atau Indonesia. Dari Asia Tenggara, tanaman ini menyebar ke daerah Amerika Tengahdan daerah tropis lainnya seperti Srilanka, Malagasi, Karibia, Hawaii dan AustraliaUtara. Di Indonesia manggis disebut dengan berbagai macam nama lokal seperti manggu (Jawa Barat), Manggus (Lampung), Manggusto (Sulawesi Utara), Manggista (Sumatera Barat). 

Harga manggis di Eropa, AS, Kanada, Jepang dan Korea bisa mencapai 2 US $ per butir. Dengan kurs Rp 9.000,- per 1 US $, maka harga satu butir buah manggis mencapai Rp 18.000,- di tingkat konsumen di negara pengimpor. Harga tiap kilogram buah manggis, mencapai Rp 72.000,- kalau isinya 8 butir. Namun tidak semua manggis yang dihasilkan dari satu pohon bisa diekspor seluruhnya. Manggis dari kebun rakyat, hanya bisa diekspor sekitar 20 sd. 30% nya. Hingga harga buah ini di tingkat petani masih berkisar Rp 300,- per butir atau Rp 3.000,- per kg. isi 10 butir.

Kendala utama pengembangan kebun manggis adalah umur berbuahnya yang lama. Di alam, tanaman manggis baru akan berbuah pada umur 10 sd. 12 tahun. Namun, kelebihan tanaman manggis adalah, akan tetap produktif sampai umur ratusan tahun. Para calon pekebun, akan berpikir ulang kalau harus investasi sampai belasan tahun baru mulai menghasilkan. Karenanya di Thailand, para petani menyisipkan tanaman manggis di sela-sala pohon durian mereka. Setelah manggis berproduksi, tanaman duriannya bisa dibuang, atau tetap dibiarkan selama masih menguntungkan. Bagi para petani Thailand, secara ekonomis tanaman manggis lebih menguntungkan daripada durian.

APETALA1 adalah gen penyandi faktor transkripsi yang dengan atau tanpa gen pembungaan lainnya, berperan dalam transisi perkembangan vegetatif ke pembungaan (Pelaz et al., 2001; Pena et al., 2001; Putterill et al., 2004). Homolog gen APETALA1 telah berhasil diklon dari organ bunga kakao. Pendekatan bioinformatika yang dikombinasikan dengan beberapa teknik biologi molekuler terbukti dapat digunakan untuk mengisolasi gen pembungaan kakao full length APETALA1. 

Pendekatan kloning gen relatif lebih sederhana daripada cara yang umumnya digunakan, misalnya melalui penapisan (screening pustaka cDNA). Dengan primer heterologous yang dirancang berdasarkan sekuen homolog gen APETALA1 dari berbagai spesies yang dapat diakses dari bank gen (genebank) melalui situs http://www.ncbi.nlm.nih.gov atau http:// www.ebi.uk, cDNA homolog APETALA1 dapat disintesa dari RNA total bunga kakao dan diamplifikasi dengan teknik RT-PCR (Santoso, 2004). 

Tujuan Penulisan

1. Untuk Mengetahui Transfer Gen APETALA1 Ketanaman Manggis Untuk Mempercepat Proses Pembungaan Dengan A. Tumefaciens

Kegunaan Penulisan

1. Sebagai tugas mata kuliah dasar bioteknologi tanaman fakultas pertaanian Universitas Sumatera Utara, Medan
2. Sebagai informasi bagi pihak yang membutuhkan

TINJAUAN MASALAH

Tanaman manggis memiliki masa vegetatif yang panjang sehingga proses pembentukan bunga membutuhkan waktu 10 sampai 12 tahun untuk berbunga dengan mentranfer gen APETALA1ke tanaman manggis sehingga proses pembungaan dapat dicepat terjadi hal ini seperti Tanaman jeruk memiliki masa TBM (juvenile) yang panjang. Organ reproduktifnya tidak terbentuk hingga tanaman berumur antara 6 dan 20 tahun, tergantung spesiesnya. Konstruksi konstitutif dari gen AtLEAFY atau AtAP1, yang merupakan penginduksi pembungaan pada Arabidopsis, telah ditransformasikan dan diekspresikan di kecambah jeruk. Kedua jenis jeruk transgenik menghasilkan bunga fertile dan buah dini pada tahun pertama. Selanjutnya, ekspresi AP1 tersebut sama efisiensinya dengan LFY dalam inisiasi bunga, tidak berdampak abnormalitas pada perkembangannya. Kedua jenis tanaman transgenik tersebut juga tetap berbunga pada tahun-tahun berikutnya, dan respons pembungaan-nya dipengaruhi oleh faktor lingkungan. Selain itu, bibit biji yang berasal dari tanaman transgenik memiliki masa TBM yang sangat pendek, membuktikan bahwa fenotipe yang terekspresi tersebut bersifat stabil dan menurun (inheritance). Hasil-hasil ini membuka peluang baru dalam pemuliaan (genetic improvement) tanaman tahunan (Pena et al., 2001). 

DNA amplikon hasil RT-PCR tersebut terbukti merupakan homolog APETALA1. Setelah diklon dengan vektor-T, sekuen keseluruhan dari DNA hasil PCR tersebut, sekitar 900 pb, dapat ditentukan dengan primer universal M13. Analisis Blast (Basic Local Alignment Search Tool) menunjukkanbahwa sekuen cDNA tersebut memiliki tingkat homologi yang tinggi dengan gen APETALA1 dari beberapa spesies tanaman (Claveri & Notredame, 2003; Santoso, 2004)

BAHAN DAN METODE

Modifikasi dan transformasi genetik

Konstruk ekspresi pada tanaman dari gen TcAP1 dibuat dengan meligasikan promoter konstitutif 35S CaMV di ujung 5’ dan terminator Nos di ujung 3’ dari gen tersebut. DNA untuk ligasi ini sebelumnya dipotong dengan enzim endonuklease restriksi yang sesuai. Untuk keperluan transformasi, secara umum konstruk tersebut diposisikan di antara batas kanan (RB) dan batas kiri (LB) dari vektor transformasi biner. Vektor rekombinan yang diperoleh dimasukkan ke dalam sel A. tumefaciens, galur AGL0 kompeten dengan cara elektroforasi (Chaidamsari, 2006). Untuk menyeleksi dan mengkonfirmasi A. tumefaciens yang positif membawa konstruk ekspresi TcAP1dilakukan PCR koloni dengan primer spesifik TcAP1 pada beberapa koloni bakteri yang tumbuh pada medium seleksi. Transformasi genetik TcAP1 ke dalam sel tanaman model dilakukan dengan teknik leaf disk yang dimodifikasi dari Saint et al. (1994) sebagaimana diuraikan dalam Santoso et al. (2000). A. tumefaciens yang membawa konstruk 35S-TcAP1 ditumbuhkan dalam medium cair Luria–Bertani (LB) yang mengandung kanamisin dengan pengocokan, A. tumefaciens tersebut dikulturkan kembali pada kondisi yang sama. Potongan-potongan eksplan daun manggis, (diameter 0,5 – 1,0 cm) diinkubasi dengan kultur cair A. tumefaciens . Kokultivasi pada medium MS padat yang mengandung acetosyringon 100 ppm dilakukan selama dua hari. Setelah itu dilakukan seleksi.

Kultur jaringan

Kultur jaringan untuk regenerasi planlet manggis dilakukan dengan metode standar melalui organogenesis. Potongan eksplan daun steril dikulturkan pada medium MS padat yang mengandung BAP 0,5 ppm (Murashige & Skoog, 1962). Kultur di-inkubasi pada suhu 26 – 28oC dengan lama penyinaran 16 jam per hari. Subkultur ke medium segar. Kultur eksplan transgenik dilakukan dengan metode dan kondisi yang sama dengan non transgenik kecuali komposisi medium. Untuk seleksi dan kultur eksplan transgenik, 

Polymerase chain reaction (PCR)

PCR dilakukan untuk mengetahui keberadaan gen target. Dalam hal ini untuk mengetahui apakah planlet transgenik yang diregenerasikan dari eksplan yang telah diinokulasi dengan A. tumefaciens pembawa konstruk 35S-TcAP1. Campuran pereaksi PCR mengandung DNA cetakan (template), sepasang primer DNA spesifik TcAP1, Polimerase DNA Taq 1 – 2,5 Unit. Reaksi dilakukan dengan volume 25 atau 50 µL dan program termal sebagai berikut: denaturasi pada suhu 94 oC selama 30 detik, pemasangan (annealing) pada suhu 50 oC selama 30 detik, pemanjangan pada suhu 72 oC selama dua menit, dan ulangan 35 siklus. Hasil PCR diperiksa menggunakan gel agarosa konsentrasi 0,7 – 1% yang telah diberi etidium bromida (Sambrook et al., 1989)

Contoh transfer gen apetala1 ketanaman tembakau untuk mempercepat proses pembungaandengan a. Tumefaciens

KESIMPULAN

1. APETALA1 adalah gen penyandi faktor transkripsi yang dengan atau tanpa gen pembungaan lainnya, berperan dalam transisi perkembangan vegetatif ke pembungaan
2. Konstruksi konstitutif dari gen AtLEAFY atau AtAP1, yang merupakan penginduksi pembungaan pada Arabidopsis, telah ditransformasikan dan diekspresikan di kecambah jeruk. Kedua jenis jeruk transgenik menghasilkan bunga fertile dan buah dini pada tahun pertama
3. Hasil-hasil ini membuka peluang baru dalam pemuliaan (genetic improvement) tanaman tahunan

DAFTAR PUSTAKA

• Chaidamsari T, :Budiani, A: Poerwanto, R: Santoso D, 2006 Ekspresi fenotipe gen APETALA1 kakao (TcAP1) pada eksplan tembakau Menara Perkebunan, 2006, 74(1), 1-9
• Chaidamsari, T., Samanhudi, H. Sugiarti, D. Santoso, G.C. Angenent & R.A. de Maagd (2006). Isolation and characterization of an AGAMOUS homologue from cocoa. Plant Sci., 170, 968-975.
• Claveri, J.M. & C. Notredame (2003). Bioinformatics For Dummies. 2nd ed., Wiley Publishing, Inc., New York, pp 215-238.
• http://www.warintek.ristek.go.id/pertanian/manggis.pdf
• http://foragri.blogsome.com/peluang-berkebun-manggis
• Kitahara K., Y. Hibino, R. Aida, S. Matsumoto (2004). Ectopic expression of the rose AGAMOUS-like MADS-box genes 'MASAKO C1 and D1' causes similar homeotic transformation of sepal and petal in Arabidopsis and sepal in Torenia. Plant Sci., 166, 1245-1252.
• Murashige, T. & F. Skoog (1962). A revised medium for rapid growth bioassays with tobacco tissue culture. Physiol. Plant., 15, 473-497.
• Pelaz, S., C. Gustafson-Brown, S.E. Kohalmi,
• Pena, L., M. Martín-Trillo, J. Juárez, J.A. Pina, L. Navarro & J.M. Martínez- Zapater (2001). Ekspresi fenotipe gen Constitutive expression of Arabidopsis LEAFY or APETALA1 genes in citrus reduces their generation time. Nature Biotechnol., 19, 263-267.
• Putterill, J., R. Laurie & R. Macknight (2004). It's time to flower: the genetic control of flowering time. BioEssays , 26, 1-11.
• Saint, S.L., K.K. Oduro & D.B. Furtek (1994) Genetic transformation of cocoa leaf cells using Agrobacterium tumefaciens. Plant Cell Tiss. & Org. Cult., 37, 243-251.
• Sambrook J, EF Fritsch & T Maniatis (1989) Molecular Cloning, a Laboratory Manual, Book 1 and 2, 2nd ed. New York, Cold Spring Habor Laboratory.
• Santoso, D., F.I. Cugito & H. Minarsih (2000). Development of tobacco plant cells in the presence of kanamycin at various levels for transgenesis. Menara Perkebunan, 68, (1), 21-28.
• Santoso, D. (2004). Molecular and genetic engineering studies toward improvement of cacao bean production. RUTi Annual Report 2004. IBRIEC, Bogor, 54p.
• Stone, S.L., L.W. Kwong, K.M. Yee, J. Pelletier, L.C. Lepiniec, R.L. Fischer, R.B. Goldberg & J.J. Harada (2001). LEAFY COTYLEDON2 encodes a B3 domain transcription factor that induces embryo development. PNAS, 98, 11806-11811.
• Wagner, D., R.W. M. Sablowski & .M. Meyerowitz (1999). Transcriptional activation of APETALA1 by LEAFY. Science, 285, 582-584.
• Wagner, D., F. Wellmer, K. Dilks, D. William, M.R.Smith, P.P. Kumar, J.L. Riechmann, A.J. Greeland & E.M. Meyerowitz (2004). Floral induction in tissue culture: a system for the analysis of LEAFY-dependent gene regulation. The Plant J., 39, 273-282.
• Yalovsky, S., M. Rodríguez-Concepción, K. Bracha, G. Toledo-Ortiz & W. Gruissem (2000). Prenylation of the floral transcription factor APETALA1 modulates its function. Plant Cell, 12,: 1257-1266.

Categories: Bioteknologi dan Pemuliaan Tanaman